A Szentágothai János Kutatóközpont a PTE korszerű, nemzetközi tudományszervezési és menedzsment normák szerint kialakított új intézménye, amely az élettudományi, élettelen természettudományi, valamint környezettudományi oktatás...
Bevezető Általános leírás
A 3-dimenziós egyedi molekula-detektálást (3D-SMD) a HILO módszerrel valósítjuk meg. A HILO módszer (Highly Inclined and Laminated Optical) a TIRF módosítása. A TIRF-höz képest kissé csökkentjük a beesési szöget, így a gerjesztő nyaláb nem szenved teljes visszaverődést, hanem áthatol a mintába. Egy vékony mintaszeletet világít meg ezzel kontrasztos képet szolgáltat mélyebb mintasíkokban. A minta optikai tengely irányú mozgatását egy piezo Z-mozgató végzi, ezzel lehetővé téve a minta 3-dimenziós vizsgálatát..
Mikroszkóp: Olympus IX83
Elérhető lézerek: 488 nm, 639 nm
Objektívek: UMPLFLNW 20x, UAPON OTIRF 100x OIL,
Kamera: Hammamatsu Orca-Flash 4.0
Z mozgató: Physik Instrumente, PI E-709 piezo Z stage
A TIRF mikroszkópban (Total Internal Reflection Fluorescence, Teljes visszaverődés) a gerjesztő nyaláb teljes visszaverődést szenved a fedőlemez-minta határfelületen. Ekkor a fedőlemez kb. 150 nm-es környezetébe behatol az úgynevezett evaneszcens hullám és csak ebben a viszonylag szűk rétegben jön létre a fluoreszcens jelölők gerjesztése. Jó időbeli felbontással kontrasztos jelet szolgáltat viszonylag keskeny térrészben, ezáltal pl. sejtmembránok vizsgálatához vagy egyedi molekula lokalizációhoz kiválóan alkalmas ez a műszer.
Váz: Olympus IX81S1F-ZDC2
Kamera: Hamamatsu C9300
Lézerek: 491nm, 640nm
Objektivek: 10x, 20x, 60x, 100x
A „Structured Illumination Microscopy” (SIM) esetében a gerjesztő nyaláb modulálásával érik el a felbontás növelését, úgy hogy a gerjesztő megvilágitási mintázat a hely függvényében változik. A SIM kép készítése során az adott és ismert mintázattal különböző irányokból és különböző fázisokban világítják meg a mintát. Az így mért két-dimenziós képek Fourier analízisével nagyjából felére lehet csökkenteni az x-y irányú felbontást. A módszerrel kb. 33 fps sebességű képalkotás is elérhető, ezáltal dinamikai vizsgálatokra is alkalmas. A Nano-Bio-Imaging Core Facility-ben elérhető mikroszkóp élő-sejtes vizsgálatokra is alkalmas, mivel CO2 és hőmérséklet inkubátorral felszerelt.
Mikroszkóp: Zeiss Elyra S.1
Objektívek: Plan-Neofluar 10x/0.30, Plan-APO 40x/1.4 Oil, Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil, Alpha Plan-APO 100x/1.46 Oil
Lézerek: 405 nm, 488 nm, 561 nm és 642nm
Szűrők:405nm excitation (MBS 405 + EF BP 420-480 / LP 750), 488nm excitation (MBS 488 + EF BP 495-550 / LP 750), 561nm excitation (MBS 561 + EF BP 570-620 / LP 750), 642nm excitation (MBS 642 + EF LP 655)
Kamera: Andor iXon EMCCD
A Stimulated Emission Depletion (STED) mikroszkópban a megvilágítás kiegészül az úgynevezett STED nyalábbal. Ez a STED nyaláb koncentrikus a gerjesztő nyalábbal és fánkszerű intenzitással rendelkezik. A STED nyaláb -az intenzitásától függő mértékben- kényszerített emisszióval alapállapotba juttatja a gerjesztett fluorofórokat, ezzel a folt mérete, ahol hatékony gerjesztés valósul meg, lecsökken. Ezzel a módszerrel kb 50 nm-esre csökkenthető az x-y irányú felbontás.
Rendszer: Abberiror Intruments Expert Line / FLIM,
Váz: Nikon Eclipse Ti2
Gerjesztési hullámhosszak: 488 nm, 561 nm, 640 nm
STED lézer: 775 nm
Objektív: SR HP Apo F 100xAC OIL
Detektor: HybridGasp, APD
Egyedülálló pontszerű forrás két-dimenziós képére egy hengerszimmetrikus (praktikusan Gauss-görbe) függvényt illesztünk, annak a középpontja nagy pontosággal adja vissza a forrás helyzetét. A jelölt mintákon viszont nagy sűrűséggel helyezkednek el a fluorofórok, emiatt ez a módszer közvetlenül nem alkalmazható. Erre egy lehetséges megoldás a fluorofórok jelének időbeli szeparálása, amit a STORM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy) technika valósít meg. Ekkor az eredetileg sötét fluorofórok közül minden képalkotás előtt annyit kapcsolunk be, hogy a függvényillesztés még torzításmentesen elvégezhető legyen. Ezután ismétlődnek az aktivizáció – képalkotás lépések. A sok lépés szolgáltatja a vizsgált minta szuperrezolúciós képét.
Mikroszkóp: Nikon Eclipse Ti2-E
Elérhető lézerek: 405 nm, 488 nm, 561 nm, 647 nm
Objektívek:Plan Apo lambda 4x, Plan Apo lambda 10x, Plan Apo VC 20x, Plan Apo lambda 60x OIL, SR HP Apo TIRF 100xAC OIL
Konfokális detektor: Nikon C2
Kamera: Hammamatsu Orca-Flash 4.0
A kétfoton effektus egy olyan folyamat, amely során két foton egyidejű elnyelésével kerül gerjesztett állapotba valamely festékmolekula. Egy ilyen esemény hatáskeresztmetszete általában igen kicsi, ám a valószínűsége a fotonsűrűség négyzetével arányos. A nano-bio-imaging core facillity-ban elérhető mikroszkópban a mintára fókuszált infravörös lézerimpulzus gyújtópontjában akkora fényintenzitást állítunk elő, hogy a látható tartományban elnyelő fluoreszcens festékünket a kétfoton effektus segítségével tudjuk gerjeszteni. A 2-foton effektus következtében a festék csak a fókuszpont körülötti kis térfogatban (~ 1 µm3) gerjesztődik. A kétfoton-gerjesztés nem érinti a minta fokális térfogaton kívül eső részeit, így több nagyságrenddel csökkenti azon sejtpusztító hatásokat, amelyek limitálják a lézersugárral végzett in vivo vizsgálatokat. Előnyei: akár 800-1200 µm mélységben is mérhetünk, fokális gerjesztés, nagy detektálási látőszög, a gerjesztőlézer hullámhossza hangolható, kHz-es mintavételezés érhető el és pásztázó eljárással akár három-dimenziós kép is készíthető.
A nano-bio-imaging core facillity-ban kiépített konfiguráció, éber egereken agyi aktivitás in vivo vizsgálatát is lehetővé teszi.
Mikroszkóp: Femto2D-SMART 2-foton mikroszkóp
Lézer: Mai Tai HP (690-1040 nm)
A stimulált Raman szórás (SRS, Stimulated Raman Scattering) szintén két foton egyidejű elnyelésekor jöhet létre. A spontán Raman szórással ellentétben, ebben az esetben a vizsgált molekula a megfelelő energiájú pumpáló és Stokes foton egyidejű abszorpciójával jut gerjesztett állapotba. A folyamat rezonáns jellege miatt az SRS nagyságrendekkel érzékenyebb mint a spontán Raman szórás, ugyanakkor a kétfoton effektus előnyeivel is rendelkezik a rendszer. Nevezetesen: csak a fókuszpont körülötti kis térfogatban gerjesztődik a minta és akár mm-es behatolási mélység is elérhető. Ezzel a rendszer képes Ca2+ imaging-re és "label free" sejt azonosításra.
Mikroszkóp: Femto3D-AO mikroszkóp
Lézer: Avesta Topol 1050-C (770-970 nm)
Barabás K, Godó S, Lengyel F, Ernszt D, Pál J, Ábrahám IM, Horm Behav. 2018 Aug;104:183-191. doi: 10.1016/j.yhbeh.2018.05.008. Epub 2018 May 19.
